文章速读：

解脂耶氏酵母Yarrowia lipolytica是构建细胞工厂的优良底盘，但长期受限于同源定向修复（HDR）效率低、中性整合位点匮乏以及筛选假阳性率高等瓶颈。浙江大学于洪巍/叶丽丹课题组开发了一套高效协同的CRISPR-Cas9遗传工具箱：1）系统表征了55个表达强度跨越12.88倍的中性整合位点；2）建立了结合菌落形态与荧光的双信号筛选平台，有效排除了非同源末端连接（NHEJ）导致的假阳性干扰；3）设计了Cas9-Sae2融合同步增强系统，将单基因同源重组效率提升至77.5%，双位点编辑效率达64.1%，且不破坏基因组稳定性或影响细胞宿主生长。本研究为复杂代谢途径的精准组装与按需调控提供了底层工具。

正文导读：

解脂耶氏酵母凭借其出色的脂质代谢能力和高前体通量，在油脂及高价值天然产物的生物制造中展现出巨大潜力。然而，在该底盘中实现多基因复杂代谢途径的精密组装与稳定表达，长期面临两大核心瓶颈：一是缺乏足够数量且表达强度可控的中性整合位点；二是非同源末端连接（NHEJ）修复机制占据主导，导致同源定向修复效率低。

（1）构建系列强度梯度的中性整合位点库

为解决多基因表达位点匮乏问题，研究团队基于必需基因数据库，在酵母基因组的必需基因对之间筛选非编码间隔区。以hrGFP为报告基因，团队成功挖掘并表征了55 个中性位点，这些位点展现出1.02至12.88倍的转录调控动态范围，并被划分为低（19个）、中（22个）、高（12个）三种表达强度梯队。该元件库为多基因途径的按需调控和代谢流平衡提供了坚实基础。

（2）建立双信号平台破除假阳性

传统依靠单表型评估同源重组效率的方法，极易因NHEJ介导的随机整合产生高额假阳性。为此，研究团队利用调控菌落形态的RAS2基因，设计了RAS2敲除与hrGFP荧光基因整合相耦合的“形态-荧光”双信号筛选体系。定量评估显示，传统单标记筛选测得的“同源重组效率”中包含了高达~45%的假阳性，且随着同源臂变短，假阳性率显著上升。该双信号平台为高通量、无假阳性地定量评估同源重组效率提供了可靠的工具。

（3）通过“切割-切除”空间偶联提升重组效率

传统通过全局敲除或过表达重组因子的策略，往往会引发细胞周期停滞或基因组不稳定。研究团队提出了一种“切割-切除”空间偶联的新思路——将核酸外切酶Sae2与Cas9直接融合，使外切酶活性精准局域化在DNA双链断裂（DSB）靶点附近。在使用500 bp同源臂的情况下，该系统将单基因整合效率从46.5%提高至77.5%，双基因整合效率亦达到了64.1%。更重要的是，该系统基于质粒表达，编辑完成后可通过质粒丢失迅速恢复宿主的野生型生理状态。

研究意义：

该工具箱不仅极大扩充了解脂耶氏酵母的遗传操作元件库，还提出了一种瞬时、精准、低生理负担的基因组编辑强化新范式。这为后续开展基于解脂耶氏酵母的合成生物学研究，尤其是多基因复杂代谢通路的高效构建，提供了坚实、可靠且极具应用价值的方法学支撑。

论文信息：

A CRISPR-Cas9 Toolkit Enabling Tunable Integration and Transient Homologous Recombination Enhancement in Yarrowia lipolytica

Tang-Lei Zhang（张汤磊）, Ming-Kai Chen（陈明凯）, Yue-Min Li（李悦旻）, Hong-Wei Yu（于洪巍）, Li-Dan Ye（叶丽丹）*

Biotechnology and Bioengineering

DOI:10.1002/bit.70276

原文链接：

https://analyticalsciencejournals.onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1002/bit.70276

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期刊简介：

Biotechnology and Bioengineering (BIT) 为全球生物技术研究者搭建了一个国际化的交流平台。作为该领域首本专注于生物技术的期刊，聚焦于对生物技术工艺具有即时影响与长远意义的研究成果，本刊为生物化学工程科学的发展做出了重要贡献。

2025 JIF：3.9 ｜ CiteScore：7.8

https://analyticalsciencejournals.onlinelibrary.wiley.com/journal/10970290

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