期刊名：Viruses

期刊主页：https://www.mdpi.com/journal/viruses

原文链接：https://www.mdpi.com/1999-4915/18/6/620

论文标题：RNA Folding Energy of Long-Range Genomic Interactions Regulates Discontinuous Transcription in SARS-CoV-2

研究背景

冠状病毒是一类基因组庞大且结构复杂的正链单链RNA病毒，其基因组在功能上可划分为两个核心区域：5′端约三分之二编码pp1a和pp1ab多聚蛋白，这些蛋白经翻译后加工形成病毒复制酶复合物，承担RNA复制与转录的核心任务；3′部分编码结构蛋白和辅助蛋白，这些蛋白通过称为不连续转录的独特转录机制表达。该过程产生一组嵌套的负义亚基因组 RNA ((-) sgRNA)，每个都充当合成相应正义亚基因组 mRNA ( (+) sgmRNA) 的模板，从而驱动蛋白质生产。然而，尽管该病毒各基因的TRS核心序列高度保守，不同基因的转录产量却呈现稳定而悬殊的比例，这一现象长期未获合理解释。近期，波士顿大学医学院Daniel Cifuentes教授研究团队在《Viruses》期刊发表研究论文，通过链特异性RNA测序、RNA-RNA互作作图、RNA折叠能量预测及靶向突变等多种手段，系统揭示了SARS-CoV-2中(−)亚基因组RNARNA（(-) sgRNA）合成的调控规律。

研究内容

现有研究表明，冠状病毒在“不连续转录”过程中，聚合酶沿基因组前进遇到体内的转录调控序列（TRS-B），便可通过与5′端TRS-Leader（TRS-L）序列的碱基互补配对实现模板切换，从而产生一组共享前导序列的嵌套式 (-) sgRNA。这些负链产物随后作为模板，用于合成翻译所需的 (+) sgmRNA。目前关于冠状病毒转录的传统研究多基于 (+) sgmRNA的定量分析，但正链产物并非不连续转录的直接产物，其丰度易受mRNA降解等转录后因素干扰，无法真实反映模板切换的实际频率。而 (-) sgRNA因缺乏poly(A)尾且序列高度嵌套，常规RNA测序技术难以对其进行直接定量，导致这一关键分子类别的调控机制长期未获系统解析。

为精准捕获转录的直接产物——(-) sgRNA，Daniel Cifuentes教授研究团队开发了基于QuantSeq-Flex的链特异性RNA测序策略。该方法巧妙利用所有 (-) sgRNA共享同一保守3′末端的特点，设计特异性引物引导反转录，继而通过随机引物合成第二链并引入固定接头，结合针对前导序列的扩增引物，成功构建了以TRS-L:TRS-B连接点为诊断标记的测序文库（图1）。应用该方法对重组小鼠肝炎病毒（recombinant mouse hepatitis virus，rMHV）和SARS-CoV-2感染细胞进行系统分析后，揭示了两组截然不同的表达景观：MHV的(-) sgRNA呈现从基因组3′端向5′端递减的连续梯度，而SARS-CoV-2则表现为基因间高低交替的非连续模式。尽管表达模式迥异，两种病毒的 (+) sgmRNA丰度均与对应 (-) sgRNA呈显著正相关，证明 (-) sgRNA的合成效率是决定下游蛋白表达水平的首要因素。随后，通过构建ORF8缺失突变体，研究进一步排除了基因线性距离对SARS-CoV-2转录的决定性作用，提示各基因的转录由各自TRS的内在特性独立调控。

图 1. 冠状病毒 (-) sgRNA 产生与 (+) sgmRNA 表达相关

通过对已发表的SPLASH数据（基于补骨脂素交联的RNA-RNA互作组学）进行再分析，发现在SARS-CoV-2基因组中，前导TRS（TRS-L）与各基因体TRS（TRS-B）之间存在广泛的长程RNA-RNA相互作用，且这些互作频率与相应(-) sgRNA的丰度呈现极强相关性（R² = 0.8946）。进一步利用ViennaRNA软件预测各TRS-L:cTRS-B双链体的折叠自由能（ΔG），发现该热力学参数可定量预测(-) sgRNA的转录水平（R² = 0.59）。为验证因果关联，团队构建了两种重组SARS-CoV-2突变体：删除ORF7a基因以降低其TRS双链体稳定性，以及将ORF8 TRS下游序列替换为源自N基因的10个核苷酸以增强双链体稳定性。实验结果与预测完全一致——TRS-L与TRS-B的长程RNA互作频率直接影响sgRNA产量，从而在因果层面确证了TRS双链体稳定性对转录效率的直接调控作用。

为验证这一因果关系，研究人员构建了两类重组病毒：其一删除了ORF7a基因，使TRS双链稳定性下降，结果该基因座位的转录输出随之降低；其二在ORF8的TRS下游插入了10个增强配对稳定性的核苷酸，结果ORF8的转录水平显著上升（图2）。这两组实验在活病毒层面首次直接证实：RNA双链的“牢固程度”不仅仅是相关指标，而是不连续转录效率的一个功能性决定因子。

图2. 长程基因组内 RNA-RNA 相互作用揭示了 (-) sgRNA 表达的决定因素

最后，通过对全球SARS-CoV-2基因组变异数据的系统分析，团队发现N基因TRS-B下游第28,271位非编码核苷酸在不同变异株系中呈现显著的谱系特异性多态性：早期毒株为A，Delta变异株为缺失突变，而所有Omicron谱系则固定为U突变（图3）。该单核苷酸变异显著降低了TRS-L:cN TRS-B双链体的预测稳定性，与实验结果高度吻合。值得注意的是，Omicron变异株在N基因内部还进化出了新型TRS，可产生具有I型干扰素拮抗功能的截短N蛋白。在此背景下，经典N TRS稳定性的降低可能代表了一种精妙的进化策略——通过下调全长N蛋白的表达量，在存在替代TRS的条件下优化基因表达的平衡，从而增强病毒在宿主中的适应性。

图 3. SARS-CoV-2 基因组中 TRS 位点附近自然发生的突变及进化分析

研究意义

本研究通过整合链特异性RNA测序、RNA-RNA互作组学、热力学建模和定向遗传改造四大技术手段，首次在SARS-CoV-2中系统阐明了不连续转录的定量调控规律，揭示了RNA双链体稳定性作为转录效率核心决定因子的普适性原理。该发现不仅修正了以往过度依赖正链sgRNA分析所导致的认知偏差，更将冠状病毒基因表达的调控层面从线性基因组序列拓展至三维RNA结构空间，为理解RNA病毒如何在其连续基因组中编码“转录逻辑”提供了全新范式。在更广阔的层面上，该研究提示RNA结构热力学不仅是病毒生命周期的被动参与者，更是一套可被突变和选择所“编辑”的调控语言，为抗病毒策略的设计和减毒疫苗的理性改造提供了全新的切入角度。

作者简介

波士顿大学乔巴尼亚和阿维迪医学院副教授Daniel Cifuentes为本文通讯作者，其团队博士研究生Stephen J. Ross为本文第一作者，德克萨斯生物医学研究所Chengjin Ye博士与Luis Martinez-Sobrido教授、波士顿大学Elke Mühlberger博士，以及东安格利亚大学Simon Moxon共同参与了该项研究工作。本研究得到了霍华德·休斯医学研究所新兴病原体倡议项目的资助。

关于期刊 Viruses

Viruses (ISSN 1999-4915, IF 3.8, CiteScore 7.6) 创刊于2009年，是病毒学领域的国际开放获取期刊，专注于病毒感染、病毒分类、病毒-宿主互作、抗病毒治疗、噬菌体、病毒进化与基因组学等研究方向。期刊被 SCIE、PubMed、Scopus、MEDLINE 等权威数据库收录，最新影响因子3.8（JCR Q2），CiteScore 7.6（病毒学/传染病学 Q1）。西班牙病毒学会、意大利病毒学会、加拿大病毒学会等国际学术组织均与 Viruses 达成合作，会员可享受文章处理费折扣。期刊主页: https://www.mdpi.com/journal/viruses