期刊: Viruses

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论文链接：Effect of Acid-Stabilizing Hemagglutinin Mutations on Immunogenicity and Heterologous Protection by H1N1 Influenza Virus mRNA-LNP Vaccines

研究背景

流感每年导致全球约10亿人感染、50万人死亡，但现有季节性流感疫苗因病毒抗原漂移和疫苗株与流行变异株不匹配而有效性有限，亟需开发能提供广谱保护的流感疫苗。血凝素（hemagglutinin，HA）是流感病毒的关键表面糖蛋白，也是疫苗诱导中和抗体的主要靶点；HA远离膜的头部结构域高度可变、诱导株特异性抗体，而保守的近膜茎部结构域可诱导广谱保护性抗体。HA在内体酸性环境中发生构象变化以启动膜融合，不同毒株的激活pH不同。HA的构象稳定性是控制病毒感染性、传播和宿主范围的关键因素。已发现多种突变（如E47K、K58I等）可增强H1N1 HA蛋白的酸稳定性，且其他病毒融合糖蛋白融合前结构的稳定突变已被证明能提高疫苗效力。核苷修饰的mRNA-脂质纳米颗粒（mRNA-LNP）疫苗具有抗原设计快速且简单、可诱导强效中和抗体反应及T细胞反应等优点，但实现广谱保护常需高剂量的mRNA或复杂的免疫方案。美国圣裘德儿童研究医院Charles J. Russell团队在《Viruses》发表研究。团队提出假设：将mRNA-LNP平台的强免疫原性与稳定性增强的HA抗原相结合，可增强疫苗的保护广度和效力并可能减少剂量。为了研究增强HA稳定性对流感疫苗免疫原性的影响，作者制备了携带不同酸稳定性突变的H1N1 HA mRNA-LNP疫苗，发现这些突变均能提高HA酸稳定性，但只有同时提高HA细胞表面表达的突变才能增强免疫原性和保护效果。

研究内容

•mRNA-LNP体外转染后野生型与突变型HA蛋白的表达

来自A/California/07/2009（CA09）pandemic H1N1（pH1N1）病毒株的HA蛋白氨基酸序列，经过密码子优化以用于野生型（WT）mRNA-LNP疫苗中的mRNA表达。随后设计了HA2茎部突变E47K、K58I、R106K和K153E。对修饰后的HA mRNA疫苗转录本进行合成，然后通过FPLC纯化。

为了研究以上突变对HA蛋白表达和裂解的影响，将mRNA-LNPs转染至HEK-293T细胞并进行蛋白质印迹分析。在无胰蛋白酶条件下，K58I和K153E突变体的总表达水平与WT相当，而E47K和R106K的表达量分别降至WT水平的66%和42%（图1A、B）。TPCK胰蛋白酶处理的HA总表达量与WT相比无显著差异，但R106K的表达呈下降趋势（图1C、D）。所有组的裂解效率一致，在WT和突变体转染的细胞中，约50%的HA蛋白被裂解（图1E）。进一步通过流式细胞术评估了HEK-293T细胞的细胞表面表达动力学（使用非构象依赖性的单克隆抗体（mAb）163-06，该抗体可结合pH1N1 HA蛋白头部区域的融合前和融合后两种构象）。转染后24 h和48 h，未裂解突变体的表面表达与WT相似，但R106K除外，其在24 h和48 h时的表达量分别显著降低至WT的53%和61%（图1F）。但当用胰蛋白酶处理细胞以模拟融合感受态时，表面表达模式发生改变。R106K的表达在24 h时为WT的85%，但在48 h时仅为WT的55%。由于HA0条带强度也受到影响，这些结果可能表明R106K的翻译有所减少。K153E的表达在24 h时为WT的122%，并在48 h时为WT表达的140%。E47K在转染后48 h时也为WT水平的140%（图1G）。这一趋势在小鼠骨髓来源的树突状细胞（mBMDC）中得到了重现。R106K在24 h时的表达降至WT的70%，而E47K、K58I和K153E在转染后48 h时的表达水平显著高于WT，分别为WT的205%、173%和212%（图1H）。

图1. mRNA-LNP 疫苗 HA 抗原表达。

（A, B）通过Western blot检测转染后24 h HEK-293T细胞中未裂解HA的表达。（A）使用pCAGGS表达的HA和NA作为对照的印迹图。（B）未经TPCK胰蛋白酶处理的HA表达，通过ImageJ 量化平均灰度值。（C-E）用TPCK胰蛋白酶于37°C处理转染细胞15 min，确定HA的表达和裂解百分比。（F, G）通过流式细胞术检测瞬时转染的HEK-293T细胞上HA蛋白的细胞表面表达。（H）在用mRNA-LNP转染的小鼠骨髓来源树突状细胞中检测HA的细胞表面表达。

•HA突变体的体外稳定性

为了确认这些突变对CA/09 HA酸稳定性的影响，作者在Vero细胞中进行了合胞体形成实验。野生型HA在pH 5.5时介导细胞间融合，而突变体均需要更强的酸性条件才能触发融合（图2A）。为了进一步确认突变型HA蛋白的构象稳定性，检测了mAb FluA-20的结合情况。与pH 7.0相比，在pH 5.0时FluA-20与野生型HA的结合更高，表明酸化后FluA-20表位的暴露（图2B）。通过在pH 6.2至5.0范围内检测FluA-20与突变体的结合，确定了几何平均荧光强度（geometric mean fluorescence，GMF）变化50%时的pH值（图2C、D）。在pH 5.8时，E47K、K58I和R106K与FluA-20的结合相较于WT显著降低。K58I在pH 5.6和5.4时也均显著低于WT。这些结合特征与计算出的50%结合pH值一致（图2D）。刺激FluA-20与E47K、K58I和R106K结合所需酸性的变化表明，这些突变体表位的可及性降低，这与HA头部构象稳定性增强一致。WT与K153E结合特征之间没有差异，表明K153E具有更强的功能稳定性，且不影响HA头部构象。这些数据表明E47K、K58I、R106K和K153E突变增强了HA的功能稳定性，但对区域构象有不同的影响。

使用广谱中和单克隆抗体（bNAbs：CR6261、CR9114和CT149）检测了HA茎部的抗原构象。这些抗体结合HA胞外域的近膜区域。在无胰蛋白酶条件下，R106K与CR6261、CR9114和CT149的结合均降低，约为WT的44–49%（图2E）。该结果与通过mAb 163-06 结合头部区域评估的R106K表达降低一致。与WT相比，K153E在未裂解状态下与CT149的结合显著降低。然而，E47K、K58I和K153E与CR6261和CR9114的结合相似。经胰蛋白酶处理后，CR9114与R106K的结合显著降低。胰蛋白酶裂解完全恢复了CT149与K153E的结合。此外，与WT相比，裂解显著增强了CR6261与A螺旋（CR6261的主要结合区域）突变体E47K和K58I的结合（图2F）。以上结果表明，这些突变稳定了三聚体，但也可能诱导微小的局部构象改变，这些改变因蛋白水解裂解而异。

图2. HA茎部突变体的稳定性。

（A）mRNA-LNPs转染Vero细胞，通过合胞体形成试验测定激活pH值。（B–D）将pCAGGS表达质粒HA构建体转染至Vero细胞，通过流式细胞术测定FluA-20 mAb的结合情况。（E,F）通过流式细胞术测定广谱中和抗体对突变型HA结合与WT的比较。

•针对pH1N1病毒的免疫原性和保护作用

为了评估单剂疫苗的免疫原性，以肌内注射方式给DBA/2J小鼠接种0.1、0.5或1.0 µg的HA mRNA-LNP，27天后采集外周血，并检测针对Cal09、A/Michigan/45/2015（MI015）和A/Brisbane/2018 pH1N1病毒的血凝抑制（hemagglutination inhibition，HAI）和中和（neutralization，NT）滴度。接种0.5或1.0 µg HA野生型mRNA-LNP后，诱导针对同源Cal09毒株以及异源A/Michigan/45/2015和A/Brisbane/2018毒株HAI和NT滴度 > 1:128（图3A、B）。在1.0 µg剂量下，K58I和K153E突变体均诱导了比WT更高的针对Cal09的HAI和NT滴度。在1.0 µg剂量下，E47K和K58I突变体诱导了针对MI015的更高滴度，但对NT滴度无影响。针对Brisbane/18的HAI和NT滴度与WT相比，除K153E的NT滴度显著高于WT外，其余突变体均无显著差异。以上数据表明，HA稳定突变体K58I和K153E能显著地增强针对匹配毒株和近缘毒株的体液免疫原性。

另取几组DBA/2J小鼠分别接种1.0 µg HA mRNA-LNP、四价流感疫苗（QIV）对照或PBS，所有小鼠在28天后用同源病毒A/California/04/2009进行攻毒。PBS处理的对照组小鼠出现快速体重下降（>25%）和100%死亡率（图3C、D）。QIV疫苗接种小鼠平均体重下降约13%，存活率为100%。在HA mRNA-LNP疫苗接种组中，最严重的体重下降为2%，且存活率为100%。结果表明，单剂1.0 µg的HA mRNA-LNP疫苗具有高度免疫原性和对同源攻毒的保护作用。

图3. 针对pH1N1病毒的免疫原性和保护作用。

DBA/2小鼠接种mRNA-LNP疫苗。一组小鼠仅注射PBS，另一组接种QIV作为对照。（A）HAI滴度，（B）NT滴度对pH1N1病毒系列进行检测。（C,D）接种1 µg mRNA-LNP的DBA/2J小鼠在疫苗接种后第28天用A/California/07/2009（pH1N1）攻毒。监测小鼠从攻毒后14天内的体重和存活率。

•针对季节性和A/Puerto Rico/8/1934 H1N1病毒的非中和性异源免疫

为了研究异源免疫原性，作者使用一组季节性H1N1病毒检测了接种加强针的小鼠血清的HAI和NT滴度。在1 µg剂量下，所有疫苗组的HAI和NT滴度大多低于检测限（图4A、B）。与WT相比，E47K、K58I和R106K针对A/Solomon Islands/06的HAI滴度显著降低，而K153E的HAI滴度无显著差异。

为进一步研究针对异源H1N1毒株A/PR/8/34（PR8）的保护广度，给小鼠肌内注射方式接种0.1、0.5或1.0 µg疫苗，28天后加强免疫，首次免疫后56天采集血液，并在首次免疫后63天用5 MLD50（50 PFU）的PR8进行攻毒（图4C、D）。尽管没有中和抗体，但用致死剂量PR8攻毒的小鼠表现出不同程度的保护。接种0.1 µg K58I和K153E的小鼠分别在第1、3和4天的体重下降程度显著高于WT。在0.5 µg剂量下，接种K58I和K153E的小鼠存活率分别为40%和70%，而WT组存活率为10%。WT组的平均体重下降为26%，K58I组为23%，K153E组为19%。K153E小鼠在1.0 µg剂量下的存活率为100%，显著高于WT。K153E疫苗接种小鼠在攻毒后体重小幅下降，与这些小鼠的存活率一致。然而，1.0 µg K58I mRNA-LNP的存活率与野生型相比无显著差异（图4C、D）。这些结果表明，在0.5 µg和1.0 µg剂量下，K153E突变增强了非中和性反应，从而在异源攻毒中提高了存活率并减少了体重下降。在0.5 µg剂量下，接种K58I的小鼠存活率有相对较小的提高。

图4. 茎突变K153E增强的非中和性异源保护。

（A）HAI滴度，虚线表示血清保护水平（滴度 ≥ 40）。检测限为20，低于检测限的值在作图时记为10。（B）NT滴度，虚线表示检测限。（C,D）加强免疫后5周（初免后63天）用PR8毒株对小鼠进行攻毒。

综上，HA茎稳定突变K153E增强了HA表达，并提高了mRNA-LNP的免疫原性和对异源挑战的保护作用。并非所有酸稳定HA茎突变都能改善mRNA-LNP疫苗诱导的免疫力。E74K和R106K均未影响对同型挑战的保护，而R106K稳定突变体显示出同型血清反应性略有降低。K153E突变产生了最显著的影响，维持了抗原表达随时间推移，并诱发了体液和细胞免疫应答的增加。K153E可能在下一代流感疫苗开发中发挥作用，因为它在较低剂量下增强对同源株的免疫原性，并扩大了对变异株的保护。

作者介绍

美国圣裘德儿童研究医院宿主与微生物互作团队的Charles J. Russell博士为本文通讯作者。同一团队的 Chet R. Ojha博士为本文第一作者。2023年诺贝尔获得者 Drew Weissman参与了这项研究。本研究得到美国国家过敏与传染病研究所（NIAID）的部分资助，也得到圣裘德儿童研究医院和美国黎巴嫩叙利亚联合慈善机构（ALSAC）的支持。

关于期刊 Viruses

Viruses (ISSN 1999-4915, IF 3.8, CiteScore 7.6) 创刊于2009年，是病毒学领域的国际开放获取期刊，专注于病毒感染、病毒分类、病毒-宿主互作、抗病毒治疗、噬菌体、病毒进化与基因组学等研究方向。期刊被 SCIE、PubMed、Scopus、MEDLINE 等权威数据库收录，最新影响因子3.8（JCR Q2），CiteScore 7.6（病毒学/传染病学 Q1）。西班牙病毒学会、意大利病毒学会、加拿大病毒学会等国际学术组织均与 Viruses 达成合作，会员可享受文章处理费折扣。期刊主页: https://www.mdpi.com/journal/viruses