CRISPR-Cas技术的出现彻底改变了生命科学研究，但其应用长期以来受到一个关键因素的制约：原间隔序列临近基序（PAM）。Cas核酸酶必须识别特定的PAM序列才能结合并切割DNA，这一严苛要求使得基因组中许多潜在的治疗靶点变得“不可触及”。

虽然通过定向进化和结构改造，Cas9和Cas12a等酶的PAM识别范围已得到扩展，但这往往伴随着脱靶效应增加或活性降低的权衡。

近日，南方科技大学前沿生物技术研究院朱健康院士、梁亚峰博士、刘朋朋助理教授团队在 Advanced Science 上发表题为《Structure‐Guided Engineering of a Cas12i Nuclease Unlocks Near‐PAMless Genome Editing》的研究论文。

该研究通过对紧凑型Cas12i核酸酶（SF01）进行结构导向的改造，成功开发出KR、IKRR和STKRR三种新型变体。这些变体不仅实现了对 5’-NNTN-3’ 的“近乎无PAM”（Near-PAMless）识别，将基因组靶向范围扩大了4倍，且在保持高特异性的同时，实现了单核苷酸级别的精准等位基因编辑。

蛋白改造：从结构预测到静电补偿

研究团队首先基于AlphaFold预测的SF01结构，锁定了WED、Helical和PI结构域中与PAM双链相互作用的38个关键残基。通过半饱和突变筛选，研究人员确定了五个关键位点（E5, D165, D166, D293, E494），这些位点的突变能显著增强对非典型PAM（如5’-CATG-3’）的编辑活性。（图 1A-C）

基于此，研究团队采取了迭代组合诱变的策略：

1.静电补偿机制：引入带正电荷的残基（如D293K, V460R, E494R），增强蛋白与带负电DNA骨架的非特异性结合力，从而补偿非典型PAM识别时的能量损失；

2.结构“解锁”机制：研究发现了一个关键的辅助突变 T208I。结构模型显示，野生型中的T208参与了一个氢键网络，将PI结构域锁定在仅识别典型PAM的构象。引入T208I突变破坏了这一网络，使PI结构域更加灵活，从而容纳更多样的PAM序列。

组合后的变体（KR, KRR, STKRR）在非典型PAM（5-CATG-3）位点上的编辑效率较野生型提升了约2倍，且IKRR变体（引入T208I）进一步优化了活性。（图 1D-E）

图 1

靶向范围：解锁25%基因组空间

为了验证这些变体的实际效能，研究团队在HEK293T细胞中针对内源性位点进行了广泛测试。

•典型PAM（5’-NTTN-3’）：KR和IKRR变体保留了与野生型SF01相当的高活性（~95%），表现出极佳的通用性；而靶向范围最广的STKRR变体在典型位点活性略有下降（~75%），表现出一种活性与范围的权衡；（图 2B）

•非典型PAM（5’-NNTN-3’）：在非典型位点，工程化变体展现了压倒性优势。例如在 PDCD1 基因的5’-CATG-3’位点，STKRR变体实现了52.5%的Indel效率，是野生型的6.5倍。（图 2C）

此外，系统性PAM图谱分析证实，KR、IKRR和STKRR变体实际上仅依赖-2位的胸腺嘧啶（T），即实现了 5’-NNTN-3’ 的识别。这一突破将SF01的可靶向基因组范围扩大至超过25%，是亲本核酸酶的4倍以上。

图 2

独特优势：精准的等位基因特异性编辑

在基因治疗中，区分致病突变等位基因和野生型等位基因至关重要。研究团队以常染色体显性视网膜色素变性的致病突变 RHO P23H 为模型进行了测试。该突变产生了一个新的 5’-AGTG-3’ PAM，而野生型为 5’-AGGG-3’。

SF01变体相比于SpRY（一种近乎无PAM的Cas9变体）的显著优势：（图 3）

•高效性：SF01变体（KR, IKRR, STKRR）对突变等位基因（P23H）的编辑效率高达~77%，显著优于AsCas12a及其变体；

•高特异性：更为关键的是，SF01变体对野生型等位基因几乎没有活性。相比之下，SpRY虽然能编辑突变位点，但也对野生型位点产生了近50%的误编辑。这表明SF01变体保留了足够的PAM敏感度，能够实现单核苷酸级别的精准辨识。

图 3

应用扩展：高效腺嘌呤碱基编辑器（ABE）

研究团队进一步基于失活的dSF01（dSF01-E844A）构建了腺嘌呤碱基编辑器（ABE）。融合了TadA8e.1脱氨酶的 dIKRR-ABE 和 dSTKRR-ABE 在多个内源性位点（如 TRAC 基因）实现了高效的A-to-G碱基转换。在某些野生型无法靶向的非典型PAM位点，编辑效率高达72%至80%。（图 4）

图 4

安全性评估：范围扩大未牺牲特异性

放宽PAM识别往往令人担忧脱靶效应的增加。研究团队利用 GUIDE-tag（细胞内检测）和 Digenome-seq（体外检测）两种方法进行了全基因组脱靶分析。

结果令人振奋：虽然GUIDE-tag在细胞内捕捉到了比野生型稍多的潜在结合位点，但Digenome-seq并未显示实际切割的显著增加。这证明SF01变体在大幅扩展靶向范围的同时，维持了极高的基因组安全性。

该研究通过结构引导的工程化策略，将紧凑型SF01核酸酶升级为一套多功能的基因编辑工具包。特别是 IKRR（作为保留典型活性的通用工具）和 STKRR（作为攻克难靶位点的利器），不仅突破了PAM的限制，更在等位基因特异性筛选上展现出优于现有工具的性能，为遗传疾病的基因治疗提供了更精准、更灵活的解决方案。

南方科技大学前沿生物技术研究院博士生陈琪通、苟涵麟为论文共同第一作者，朱健康院士、梁亚峰博士、刘朋朋助理教授为共同通讯作者。该研究工作得到了深圳市科技计划项目、广东省科技计划项目的资助。

期刊介绍：

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